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单泛素化

介绍

本文主要研究单泛素化过程及其与蛋白质底物的关系。这引起了人们对蛋白质的调节的关注,几乎所有的细胞组织都有这种蛋白质。体外实验表明,在缺乏泛素连接酶的情况下,Tob家族蛋白可以发生单泛素化。单泛素化是将一个泛素部分加到蛋白质底物上。它也可以指蛋白质通过共价键连接到泛素分子上而产生的适应性。泛素是一种小蛋白,在真核生物的几乎每种组织中都存在。它还可以指导蛋白质的循环利用过程。这些蛋白质被泛素捆绑在一起,随时准备被破坏。这些蛋白质通过泛素标签定向到蛋白酶体。

蛋白酶体是细胞中的一种大蛋白复合物,它降解和回收不需要的蛋白质。泛素标签还控制其他蛋白质和细胞机制到其他位置,它们指导蛋白质采取其他活动。泛素受体通过泛素结合域连接泛素化蛋白,在多种细胞过程中具有关键作用。这些受体在大多数情况下是单泛素化的,称为偶单泛素化。在aims蛋白中加入泛素链会导致其单泛素化。这种单泛素化的目的是使蛋白质降解,同时调节受体内化和内质分类。

泛素化

泛素是一种76个氨基酸残基,与目的蛋白中的赖氨酸残基共价结合,并使其稳定性标准化。它是Tob家族蛋白的前体依赖性降解,在控制细胞周期进程和DNA损伤反应中是必需的。多种Ub连接酶被称为泛素连接酶,负责Tob蛋白的降解。这就说明了Tob家族蛋白在缺乏泛素连接酶的情况下可以进行单泛素化。

解释哺乳动物H2B泛素化的作用可以通过ubH2B特异性抗体进行广泛的促进。然而,与其他组蛋白共价修饰不同,泛素部分是一种76个氨基酸的多肽,在抗体的特异性测定区域内不能被破坏。在克服这一障碍时,应使用与人类组蛋白H2B上泛素结合位点平行的支链肽。将获得一系列ubH2B特异性杂交瘤。当抗体与人类U2OS细胞的全细胞提取物或酸提取物反应时,它识别出在ubH2B位置迁移的单个带,与非泛素化H2B或ubH2A都没有可检测的交叉反应。进一步的确认可以通过使用纯化的小牛胸腺组蛋白H2B,以及来自HEK293细胞的酸提取物进行。此外,抗体在转染野生型人H2B的细胞提取物中识别其目标,而不是在Lys 120处突变的不能进行单泛化的H2B。值得注意的是,类似的条带在隐性量中也被抗泛素抗体识别。然而,酿酒酵母ubH2B并没有被有效地识别。

小分子蛋白质泛素与赖氨酸的共价附件保留在底物蛋白质中,其发生在三个关键步骤中。泛素激活的顺序作用是蛋白质泛素化发生的第一个过程。蛋白质底物与赖氨酸的结合是酶的第二步,也是最后的连接酶。由于其多功能性,泛素化作用可调节多种细胞过程,包括信号转导、蛋白质降解、DNA修复、染色质重塑、膜转运和过氧化物酶体生物发生。泛素化可能通过构象变化来调节蛋白质的功能。这是通过泛素受体了解泛素化的蛋白质,并在那里控制下游的生化过程。

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多泛素链由至少四个亚单位组成,是确保蛋白质组识别和降解泛素化蛋白质的有效途径。然而,泛素的其他功能已被发现,不参与蛋白质体。单个泛素或短泛素链改变一些蛋白质。单泛素化不是通过蛋白小体使蛋白质死亡,而是调节从膜转运到转录调节的过程。

体外独立泛素化

体外泛素化文章主要描述了蛋白质的修饰。多泛素化的目的是破坏蛋白酶体。编码双环的PARKIN基因的突变功能障碍包含连接酶E3活性。这是常染色体隐性遗传青少年帕金森综合征的首要原因。后无名指图案负责Parkin E3活动(Khanna&Shiloh,2009)。MBP-parkin在含有全长parkin或IBR-R2的全反应混合物中表现出更高的分子量,而不是parkin C44R RING2突变体。parkin物种没有被检测到,特别是当E1或parkin被省略时。

当省略E1或parkin时,没有检测到HMW parkin物种,并且在没有E2的情况下,MBP parkin和IBR-R2似乎都能够介导自液化。FK1免疫印迹法特别识别物种,在MBP-parkin和IBR-R2反应中产生阶梯状的模式,这些反应在E2存在或不存在的情况下被催化。尽管泛素化物种是由IBR-R2产生的,但它们往往比由全长蛋白质产生的分子量更大。FK2免疫印迹法同时识别单泛素和多泛素化蛋白,它还揭示了一种类似于FK1的阶梯状模式。与ibr2催化的免疫副反应相比,FK2催化的副反应要大得多。

在parkin C441R突变体的反应中没有检测到FK1或FK2免疫反应性。Parkin介导的泛素化反应可以在E2存在或不存在的情况下发生,并且由全长Parkin和IBR-R2催化的泛素化性质不同。

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多种形式的parkin介导的泛素化很可能赋予蛋白质更大的弹性,以应对不同的细胞条件。例如,当线粒体去极化时,parkin被认为通过多种泛素连接(包括K27、K48和/或65)来修饰凹陷细胞器上的蛋白质。此外,在蛋白酶体应激期间,parkin介导K63。泛素化比将蛋白质重量从被包围的蛋白酶体中转移的能力更受青睐。泛素含有几个赖氨酸残基,它们可以作为多泛素化的点:K48、K63、K6、K11、K27、K29和K33。不同的连接可以定义由泛素结合蛋白识别的各种信号。这些蛋白质具有泛素相互作用的基序,它们与泛素结合。泛素是一种76个氨基酸残基,与目的蛋白中的赖氨酸残基共价结合,并使其稳定性标准化。它是Tob家族蛋白的前体依赖性降解,在控制细胞周期进程和DNA损伤反应中是必需的。

多种Ub连接酶被称为泛素连接酶,负责Tob蛋白的降解。这就说明了Tob家族蛋白在缺乏泛素连接酶的情况下可以进行单泛素化。泛素是一种微型调节蛋白,几乎存在于真核生物的所有组织中(普遍存在)。它在其他功能中起着整体蛋白质回收的作用。它与蛋白质结合并标记它们以备破坏。tag作为蛋白质组的指导者,蛋白质组是细胞中负责降解和再生不需要的蛋白质的一种大蛋白复合物。

标签还可以将蛋白质定向到细胞内的其他部位,以控制不同的蛋白质和细胞机制。标记跨膜蛋白从膜中清除也是泛素的另一项工作,在细胞中起一系列基准作用。这些蛋白质的一个很好的例子就是受体。泛素化是对泛素结合的细胞表面跨膜分子进行的。这种调节改变了蛋白质的亚细胞定位,通常是针对溶酶体损伤的蛋白质。蛋白质泛素化通过标记降解来控制许多蛋白质的半衰期。泛化是一个与许多高度同步的生物学结果相联系的系统,包括细胞分化、进程、逆转录病毒组装、抗原呈递、凋亡、信号转导、生物钟、转录激活、受体下调以及内吞作用。

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最近发现的泛素化和去蛋白化酶家族参与了这些过程。他们可以提供新的药物意识家庭和干预人类疾病的新方法。相反地,需要做大量的工作来确认这种方法。与Ub的共价连接是Ub前体系统降解蛋白质的特征。激活酶(泛素激活酶)最初以ATP的辅助方式激活Ub。活化后,Ub随后被转移到一种结合酶(泛素结合酶),该结合酶通过泛素连接酶(ubiquiting ligating酵素)将其最终结合到底物上的赖氨酸残基(Peng&Schwartz,2003)。

Ub修饰有多种不同的细胞作用。与Lys48相连的多聚-Ub链与蛋白质体依赖性降解有关,而与Lys63连接的多Ub链则影响DNA修复过程和内吞作用。此外,单泛素化,即单个Ub对蛋白质的共价修饰,在信号转导、内吞、DNA修复过程、组蛋白活性和逆转录病毒出芽等方面起着至关重要的作用。最近的研究表明,一系列含有Ub结合域(UBD)的蛋白质在体外能够自主地进行泛素化连接酶活性的单泛素化。当泛素结合蛋白被单泛素化时,它们在体内结合和控制泛素靶标功能的能力受到抑制。然而,如前所述,在体外没有泛素连接酶的情况下,Tob/BTG蛋白是单泛素化的。多泛素化和单泛素化作用不同。虽然单泛素化被认为是受体内化和内质分类的调节器,但多泛素化负责寻找降解的蛋白质。

此外,单泛素化的发生与轻微的多泛素化有关。因此,Tob/BTG家族蛋白的单泛素化倾向于通过影响多泛素化以及伴随的蛋白质体依赖性降解来调节其稳定性。Tob/BTG家族中的蛋白质被多泛素化,最终被26S蛋白小体降解。在这个过程中,许多E3-Ub连接酶对Tob泛素化起作用。在Tob泛素化的检测中,一种单独的缓慢迁移形式的Tob迁移通过免疫印迹证实,即使在缺乏细胞质提取物的反应中也是如此。当所有蛋白质成分都存在时产生的抗Ub抗体可以识别这一点。因此,我们了解到Tob在体外以E3s独立的方式进行单泛素化。Tob/BTG家族蛋白质中的氨基酸序列(氨基酸1-112)非常保守。在检测蛋白质家族成员间是否存在单泛素化的趋势时,结果表明Tob2家族和BTG2家族也变成了单泛素化。体外单泛素化的介体是UBCH4和UBCH5,而不是UBCH3。单泛素化位点的测定采用质谱法。在这里,大量的体外泛素化的Tob蛋白被进行SDS-PAGE。凝胶是银染的,并且是从凝胶上切下的。

然后用肽质量指纹图来检验这一点。对Tob体外单泛素化位点的Lys48和Lys63进行了鉴定。结果表明,Tob的单泛素化发生在其末端半部分。值得注意的是,Tob的Lys48和Lys63周围的氨基酸序列位于Tob/BTG家族蛋白质中高度保守的结构域中。Tob在Lys48和Lys68体外泛素化。为了证实,我们构建了Tob突变体,其中Lys48、Lys63或两者都被丙氨酸取代(相应的TobK48A、TobK63A、TobK48、63A)。一种来自TobK48A突变体的缓慢迁移形式在体外泛素化过程中产生。在TobK63A突变体的反应产物中,也可以看到一种缓慢的形式迁移,尽管数量略低于野生型Tob。Tobk4863a没有稳定的迁移形式。这表明Lys48是Tob中一个主要的单泛素化位点。这也表明Lys63在单泛素化过程中的贡献很小。这表明在所有Tob/BTG蛋白的氨基酸链中,Lys48和不是Lys63是保守的。通过将野生型Tob或Tob突变体与6xHis标记的Ub表达载体一起转染cos7细胞,研究Tob单泛素化的生物学意义。他的Ub结合蛋白然后在变性条件下用Ni-NTA琼脂糖纯化。

免疫印迹分析结果表明,与野生型Tob相比,TobK48A和TobK63A的多泛素化作用增强。这意味着Tob在Lys48或Lys63处的单泛素化在体内维持Tob的多泛素化。值得注意的是,TobK63A的多泛素化水平高于TobK48A。虽然Lys48是体外Tob泛素化的关键位点,但Lys48的单泛素化比Lys48的单泛素化对体内Tob多泛素化的影响更大。然而,由于TobK48,63A比TobK48A或TobK63A的多泛素化程度更高,Lys48和Lys63的单泛素化下调了Tob的多泛素化。

从所有这些测试中,我们发现Tob/BTG家族蛋白在体外没有E3s的情况下经历单泛素化。单泛素化的主要引证是赖氨酸残基,这些残基在成员间普遍保守。从TobK48,63A的多泛素化水平与野生型Tob相比,单泛素化抑制了多泛素化。类似地,泛素化的目的是阻止泛素化的蛋白质的泛素化反应。另一方面,含有蛋白质的UBD也可能参与其中(Peng&Schwartz,2003)。考虑到含有UBD的蛋白质识别单泛素化Tob,它们可以阻止E3s多泛素化Tob蛋白。对单泛素化Tob进行结构分析,有助于理解单泛素化抑制多泛素化的原因是分子间或分子间的关系。

在后一种情况下,识别与单泛素化的Tob相互作用的分子将是一项非常重要的工作。由于含有UBD的蛋白质通过UBD与Ub结合的E2酶相互作用而形成单泛素,Tob/BTG家族中缺乏明显的UBD。即使如此,我们也没有理由排除Tob/BTG家族的蛋白质在其氨基末端保守的排他序列可能会成为一个新的自泛素化领域的可能性。Tob有助于在无促分裂刺激的情况下使细胞处于静止状态,并阻断DNA损伤诱导的凋亡。Tob的单泛素化可能调节Tob执行这些行为的能力。

为了了解Tob的亚细胞定位和蛋白质相互作用,并在适当的时候认识到Tob moubiquitination的生物学意义,需要产生特异于Tob的抗体。最后,目前的研究发现,多泛素化程度是由其单体增溶控制的,这为蛋白质稳定提供了一种新的策略。Cbl蛋白也是主要的泛素连接酶,促进配体依赖的多泛素化,与受体酪氨酸激酶的降解一致。它们通过在具有激活受体的化合物中招募CIN85内啡肽来控制受体内吞作用。这是通过表皮生长因子(EGH)刺激后,通过Cal/Cbl-b使衔接蛋白CIN85及其同源物CMS单泛素化而实现的。

然而,CIN85的单泛素化需要CIN85和Cbl、Cbl的完整环指结构域和CIN85羧基端的泛素受体位点电流直接相互作用。Cbl-b和单泛素化CIN85与多泛素化EGF受体一起存在于复合物中,并在溶酶体中共同降解。这表明,Cbl/Cbl-b可以在CIN85单泛素化的基础上调节货物的多泛素化,以控制受体酪氨酸激酶的内质编目和降解(Khanna&Shiloh,2009)。

蛋白质泛素化通过标记降解来控制许多蛋白质的半衰期。泛化是一个与许多高度同步的生物学结果相联系的系统,包括细胞分化、进程、逆转录病毒组装、抗原呈递、凋亡、信号转导、生物钟、转录激活、受体下调以及内吞作用。许多蛋白质含有泛素结合域,也称为基序,如UIM(泛素相互作用基序)。它们被称为泛素受体,通常是通过一个需要UBD存在的程序进行单泛素化。这被称为偶联单泛素化。

最近发现的泛素化和去蛋白化酶家族参与了这些过程。许多蛋白质含有泛素结合域,也称为基序,如UIM(泛素相互作用基序)。它们被称为泛素受体,通常是通过一个需要UBD存在的程序进行单泛素化。这被称为偶联单泛素化。偶联的单泛素化高度依赖于UIM与单泛素(mUb)结合的能力。在这里,基本的分子机制是基于UIM和泛素连接酶E3之间的界面,后者已经通过泛素化进行了修饰。此外,E3连接酶的体内泛素化与其对eps15(内吞蛋白)的单泛素化能力有关。因此,泛素化E3连接酶在单泛素偶联过程中起着至关重要的作用。

受体内化和内吞作用中的单泛素化

这是配体诱导的膜受体泛素化,包括受体酪氨酸激酶,与受体内化和内吞作用有关。酵母中G蛋白偶联受体的单泛素化导致其内部化,并最终在酵母液泡中降解。其他跨膜,如渗透,运输也在单泛素化过程中进行内部化。在哺乳动物细胞中,跨膜受体和内吞衔接蛋白在配体刺激下通过泛素化运动。表皮生长因子(EGF)诱导的表皮生长因子(EGFR)的内化和组织化是Ub调节受体降解的一个突出例子。

EGFR的细胞质尾部含有唯一的Ub部分化合物的蛋白嵌合体也从细胞表面内化。它也针对晚期的内胚体室进行降解。单泛素既可内化,又可作为分选信号。EFGR是一种由Lys63连锁链组成的多聚泛素。虽然单Ub足以作为酵母内化,但Lys63的多泛素化产生更有效的内化信号,增加结合亲和力。

Ub受体的单泛素化

几种受体具有与Ub受体结合的能力,同时在配体刺激下能进行单泛素化,Bb受体的ubd以其单泛素化最为突出。这些类型的Ub受体通过一种称为偶联单泛素化的分子过程进行单泛素化。这个过程需要一个完整的UBD。使用EPS15衔接蛋白根除了偶联单泛素化的潜在分子过程。衔接蛋白经过EGF诱导。

作为模型系统的泛素化。这些过程包括Ub受体的UIM和一个已经被泛素化修饰的HECT型E3连接酶之间的相互作用。泛素受体通过泛素结合域结合泛素化蛋白,在各种细胞过程中起着关键作用。这些类型的受体通常在一个称为耦合单泛素化的过程中被单泛素化。这个过程已经被证明涉及泛素连接酶的单泛素化及其与泛素受体的界面。

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然后修饰的E3连接酶将硫醚偶联的Ub从其催化半胱氨酸残基转移到Ub受体。然后Ub受体变成。

单泛素化。Ub受体的单泛素化在决定其与泛素负载的结合能力方面也起着调节作用。泛素化反应产物是由MBP蛋白质产生的,包含被测试的各种E3成员的催化环结构域。也就是说有没有它们的同源物E2和UbcH7的存在。将单个泛素部分添加到蛋白质底物上可产生多泛素链。在一个称为多泛素化的过程中,一些底物通过向多个赖氨酸残基中添加泛素分子进行修饰。泛素共含有7个赖氨酸残基。几个泛素受体,包括控制内吞膜交通的蛋白质是单泛素化的。这种类型的修饰被称为偶联单泛素化,需要一个UBD的存在来维持这一过程。偶合单泛素化可能对分子机制产生负反馈控制。这尤其适用于那些需要泛素和它们的ubd之间短暂和连续的相互作用,从而成为自动抑制的机器。

包括泛素受体在内的复杂机制的内吞膜转运是这种调节的一个突出例子。这种机制也适用于DNA修复,其中翻译聚合酶的定位是由其结合能力控制的。泛素酶的单泛素化及其与泛素受体中UBD的相互作用对受体的偶联单泛素化非常重要(Peng&Schwartz,2003)。

parkin基因突变是早发性帕金森病常染色体隐性遗传的主要原因。Parkin作为一种泛素连接酶(E3),与泛素蛋白酶体系统(UPS)相关,UPS是细胞内关键的蛋白水解机制,起着破坏细胞内不需要的蛋白质的作用。Parkin是E3成员,它与其他重要成员联合工作。与parkin相关的成员是泛素激活酶(E1)和结合酶(E2)。parkins在其底物上催化泛素链的形成,作为蛋白酶体介导降解的靶向指示物。泛素介导的降解反应发生。降解发生在单个泛素分子的末端残基(G76)和另一个泛素分子内的点48处的内部赖氨酸(K)残基之间。泛素链组装也有可能发生在K63等分子中。

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在一个帐户,这也是显而易见的,蛋白质也可以是单泛素化(6,7)。这些非典型修饰在大多数情况下起到了非蛋白水解信号的作用。这些非蛋白水解酶参与多种细胞过程,包括DNA修复和内吞作用(7)。Parkin与蛋白质降解有关,但它是一种独特的E3,能够与K63连锁的多泛素化(8、9、10和11)一样介导单泛素化。然而,单一的酶可以表现出这样的多功能特性。值得注意的是,E2伙伴的选择可能会影响parkin介导的泛素序列组装的拓扑结构(Khanna&Shiloh,2009)。

异二聚体Ubc13/Uev-la-E2对的parkin相互作用似乎与K63连锁的多泛素化有关。但它与UbcH17的合作促进了K48相关的多泛素化(8和12)。调节parkin选择E2的决定因素,目前还不为人所知,但研究表明,pink1的parkin磷酸化增强了其ubc13(13)的募集。E2s的差异招募不能充分解释parkin的单泛素化活性。

Parkin也是E3的独特之处,它能够以一种独立于E2的方式介导泛素化,这是一个E3成员前所未有的新颖活动。特别值得注意的是,尽管全长parkin在体外催化E2单双基化,但只有C端IBR-R2区的截短突变体在没有E2的情况下同时催化单泛素和多泛素化。在IBR-R2催化而非全长parkin催化的反应产物中存在K48连接的多泛素。值得注意的是,IBR-R2形成的泛素链在E2s的存在下会发生改变。例如,当Ubc13/Uev-la取代UbcH7时,产生K48和K63连接的泛素聚合物的混合链。在含有全长parkin的反应中,不存在这样的修饰。

TSG101在识别单泛素化靶点中的作用是由LDH酶的泛素化决定的。研究发现,在正常氧气条件下,Cos-1细胞中LDH-A和LDH-B被HA标记的泛素过度表达。随后在正常氧气条件下生长,LDH-A和LDH-B在大约38kDa的水平上表达。平行westernblot分析表明,只有厌氧亚型LDH-A才应该泛素化。

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过去十年的研究表明,DNA复制、重组和组成等不同区域的融合,我们正在学习这些重要联系如何协同工作,以达到基因组的稳定性以及保证细胞的变异性。在接下来的10年里,我们可以期待对翻译后蛋白质修饰在调控中的作用以及基因组维护中的优先路径的功能性理解。通过这项研究获得的基本知识应该为人类疾病的广泛有效的临床干预提供正确的方向。这对预防和疾病控制,更不用说治疗了。它也有助于学习更多关于遗传病的知识,这些疾病在很长一段时间内被认为是不太可治愈的。

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